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庆大霉素C1a生产过程中不同样品的HPLC法检测

丁碧粉1,2，张韬1,3，李继安1，陈代杰4，林惠敏1*

(1.中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海；

2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海；3.中国药科大学，江苏南京；4.中国医药工业研究总院，上海)

摘要：参照美国药典USP37-NF32版，采用柱前衍生化-HPLC法测定庆大霉素C1a(1)对照品及生产阶段的不同样品。在检测经离子交换树脂HZ-富集后的洗脱液样品B时出现1个新的杂质峰，且检测所得1的浓度明显偏低。经LCMS分析，推测该杂质为邻苯二甲醛(OPA)不足的情况下1与巯基乙酸在碱性条件下的结合产物。经方法优化，通过稀释样品、增加衍生化试剂量及增加衍生化试剂中OPA的量，均可准确检测不同样品中1的浓度和纯度。向衍生化试剂中增加OPA，更适用于1发酵生产过程中不同阶段样品的检测。关键词：庆大霉素C1a；发酵；柱前衍生化；高效液相色谱；测定

庆大霉素C1a(gentamicinC1a，1)是庆大霉素的主要组分之一，也是合成依替米星(etimicin)的原料，常用UV法、荧光检测法、TLC法、HPLC-蒸发光散射检测器(ELSD)法、微生物检定法和HPLC法等测定1[1—7]。据此，本研究主要考察并分析了误差存在的原因，并改进HPLC检测前的衍生化步骤，以适用于1发酵生产过程的样品检测。

1仪器与材料

1.1仪器与试剂

型液相色谱仪，包括GA型在线脱气机和GA型自动进样器(美国Agilent公司)；LCQFleet?型离子阱质谱仪(美国ThermoFischerScientific公司)。1对照品(常州方圆制药有限公司，含量93.5％)；甲醇、硫酸、硼酸、异丙醇、氢氧化钠和OPA均为分析纯，巯基乙酸和庚烷磺酸钠均为色谱纯；HZ-型离子交换树脂和HZ-型大孔吸附树脂均由上海华震科技有限公司提供。

1.2菌种与培养基

棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)SIPIGM.01(本室保藏)。

2方法与结果

2.1罐发酵工艺

取甘油管菌悬液接种至斜面培养基，35℃培养9～10d后，挖块至液体种子培养基ml(ml摇瓶)中，35℃振荡(r/min)培养48h。

2.2色谱和质谱条件

HPLC色谱条件：色谱柱Nano-MicroUnisil5-C18柱(4.6mm×mm，5μm)；流动相水∶乙酸∶甲醇(20∶5∶75，含庚烷磺酸钠5g/L)；流速1.2ml/min；柱温40℃；检测波长nm；进样量20μl。LC-MS色谱条件：色谱柱Nano-MicroUnisil5-C18柱(4.6mm×mm，5μm)；流动相4％甲酸(以氨水调至pH2.0)∶甲醇(30∶70)；流速1.0ml/min；柱温20℃；进样量20μl。LC-MS质谱条件：离子源电喷雾电离源(ESI)，正离子模式；干燥器温度℃；干燥气流速10L/min；雾化气30psi；喷雾电压4kV。

2.3溶液配制

2.3.1衍生化试剂的配制

准确称取OPA1g(7.4mmol)溶于甲醇5ml中，加入巯基乙酸2ml(28.8mmol)，加入0.4mol/L硼酸(加45％氢氧化钠溶液调至pH10.4)95ml，混匀，以45％氢氧化钠溶液调至pH10.4，置4℃冰箱中避光保存。

2.3.2样品溶液配制及处理

精密称取1对照品适量(相当于mg)，置50ml量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，制得浓度为18mg/ml的1对照品溶液，置4℃冰箱保存，临用时稀释至所需浓度。

2.4衍生化反应[5,6]

准确量取样品0.25ml，置20ml试管中，加入蒸馏水3.75ml和衍生化试剂1ml，混匀，加入异丙醇5ml，充分混匀后密闭，60℃水浴15min后置冰浴中终止反应，离心(10×g)5min，进行HPLC检测。

2.5样品检测

精密吸取“2.3.2”项下所得的1对照品溶液(18mg/ml)适量，用蒸馏水分别定量稀释，制备0.1～18mg/ml系列浓度1对照品溶液。

2.6原因分析

为进一步验证上述推测，分别取1.mg/ml的1对照品溶液、样品B及样品B的5倍稀释液，分别进行衍生化，以LC-MS检测，结果在1对照品溶液和样品B稀释液图谱中均出现[M+H]+m/z.8的分子离子峰，样品B图谱中出现[M+H]+m/z.9的分子离子峰。

2.7解决方法

根据上述推理，考虑采取不同方法，即稀释样品、增加衍生化试剂量以及增加衍生化试剂中OPA的量，以期准确测定样品B中的1。

2.7.1稀释样品

将样品B(14.8mg/ml)分别按照1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8和10倍进行稀释，按“2.4”项下方法衍生化后进行HPLC检测。结果显示，对样品

B进行2倍以上稀释时，所测得的1含量由未稀释时的1.6mg/ml恢复至实际的14.8mg/ml，且不完全衍生化杂质峰消失。见图3A。

2.7.2增加衍生化试剂

分别将衍生化试剂量由原来的1ml增加到1.1～3ml，相应调整蒸馏水的量，保持反应体积不变。结果显示，当衍生化试剂量提高至1.5～3ml时，测得样品B中的1浓度恢复至实际水平，且不完全衍生化杂质峰消失。见图3B。

2.7.3衍生化试剂配比的优化

因实际生产过程中，样品中的1含量及杂质浓度未知，无法预判应对样品稀释多少倍或增加多少量的衍生化试剂，因此试图通过调整衍生化试剂中OPA与巯基乙酸的配比来实现对不同发酵液样品中1的准确测定。

3讨论

“2.4”项下的1衍生化方法仅适用于纯度较高或含量较低的发酵液样品，而在1的发酵生产过程中，不同阶段样品中1及含氨基类化合物的浓度波动范围较大，可能生成不完全衍生化产物，造成测定结果不准确。本研究采用LC-MS检测，结果发现一杂质峰，[M+H]+m/z.9。经分析，推测其为1与巯基乙酸1∶1的反应产物。通过稀释样品、增加衍生化试剂量及增加衍生化试剂中OPA的方法均能避免1衍生化不完全的问题，且第3个方法更适合检测不同发酵液样品中的1，方法简便易行，准确可靠，可为1发酵生产过程中的样品监测提供

参考。

作者简介：丁碧粉(—)，女，硕士研究生，专业方向：微生物

药物学。

E-mail：dingbifenjgh

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